求分子生物学实验讲义

【实验目的】
（1）了解实验的常规仪器、设备、耗材。
（2）掌握本实验所用仪器的功能和使用方法。
【实验内容】
一、验室的常规仪器、设备
(一) 温度控制系统：
1. 冰箱: 根据药品、试剂及多种生物制剂保存的需要，必须具备不同控温级别的冰箱，最常使用的有：4℃、-20℃、-80℃冰箱。
4℃适合储存某些溶液、试剂、药品等。
-20℃适用于某些试剂、药品、酶、血清、配好的抗生素和DNA、蛋白质样品等。
-80℃适合某些长期低温保存的样品、纯化的样品、特殊的低温处理消化液等的保存。
0-10℃的冷柜适合低温条件下的电泳、层析、透析等实验。
2．液氮罐：有些实验材料、某些器官组织、细胞株、菌株及纯化的样品等，要求速冻和长期保存在超低温环境下，就需要一个液氮罐（-196℃）具有经济、省力和较好地保持细胞生物学特性的优点。
3．培养箱：37℃恒温箱用于细菌的固体培养和细胞培养。
CO2培养箱适用于培养各种细胞，可恒定地提供一定量的CO2（通常5%），用来维持培养液的酸度（pH值）。
37℃恒温空气摇床可进行液体细菌的培养。
4. 水浴锅：用于保温。
25-100℃水浴摇床可用于分子杂交试验，各种生物化学酶反应等试验的保温。
25-100℃水浴箱用于常规试验。
5. 烘箱：主用于烘干实验器皿，有些需要温度高些，有些需要温度低些。用于RNA方面的实验用具，需要在250℃烤箱中烘干，有些塑料用具只能在42-45℃的烤箱中进行烘干。
（二）水的净化装置：随着分子生物学的飞速发展，许多实验对水纯度的要求越来越高。
1. 蒸馏水皿：单蒸水常难以满足实验要求。双蒸水、三蒸水配液，许多实验要去离子水。
多次蒸馏水可除去水中挥发性杂质，不能完全除去水中溶解的气体杂质（Mn2+、Cu2+、Zn2+、Fe3+、Mo(Ⅵ)）。
2. 离子交换器：去离子水—用离子交换法制取的水，称去离子水。
去离子效果好，但不能除去水中的非离子型杂质，其中常含有微量的有机物（树脂等）。
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3．超纯水：用蒸馏水、离子交换水、反渗透纯水做为供水，磁铁耦合齿轮泵作用使水循环。用于PCR、PCR氨基酸分析、DNA测序、酶反应、组织和细胞培养等。
（三）菌消毒设备：分子生物学所用大部分试剂，而且实验用具都应严格消毒灭菌。。
1．蒸汽消毒锅：用于小批量物品的随时消毒。大批实验物品、试剂、培养基可使用大型消毒且定时进行消毒
2. 紫外线：75%乙醇 、0.1%SDS（消毒剂）
一些耐高压、高温消毒且可用紫外线照射或乙醇和SDS浸泡。
紫外线照射使用方便，且很方便，但灭菌效果与距离有关，且产生臭氧污染安全，用于无菌室，超净台和塑料用具的消毒。
3. 滤器滤膜：不耐高温、高压的试剂用其处菌。
4. 煮沸消毒：主用于金属器械和针急需时采用。
（四） 计量系统：
1. 称量系统：（各种天平）台秤、托盘天平、钮力摆动天平、
光电分子天平、精密电子分析天平
2. 液体体积的度量：精：量筒、移液管、微量取液器
粗：刻度试管、烧杯、锥形瓶
3. pH值测量：
pH计：测定溶液中H+的直接电位的仪器，主要通过一对电极，在不同的pH溶液中产生不同的电动势用pH值表示出来。
pH试纸：只适用于培养液、酚饱和液、缓冲液或其它试剂溶液的pH值的粗略估计。而大部分试剂的配制要求严格的pH值，需精确度高（小数点后两位）的pH计。
4. OD值测量：光密度、分光光度计是利用物质在可见光和紫外线区域中的吸收光谱来鉴定该物质的性质及其含量的一种仪器。它是由光源、单色器、吸收池、接收器、测量仪表或显示屏幕所组成。OD值是许多溶液中溶质定量的方便指标之一，通过所产生的单色光而测定某一溶液对该单色光的吸收值，利用它可进行核酸溶液定量和纯度的初步判断。
（五）离心机：离心技术是研究生物的结构和功能中不可缺少的一种物理技术手段。因为各种物质在沉淀系数、浮力、和质量等方面有差异，可利用强大的离心力场，使其分离、纯化和浓缩。目前有各种各样的离心机。可供少于0.05ml到几升的样品离心之用。离心技术应用广泛，包括收集和分离细胞、细胞器和生物大分子等。据其转速的不同，可分为以下几种类型：
1. 普通离心机：最大转速6000 r/m ，最大离心力6000g
①医用或台式离心机：是离心机中最简单而廉价的，最常用于收集快速沉降系数的物质，如红细胞、粗大的沉淀物、酵母菌和细菌等。
②低速冷冻离心机：主要用于细胞、细胞核、细胞膜和细菌的沉淀和收集等。 2
2. 高速离心机：最大转速25000 r/m ，最大离心力89000g
有冷冻和常温两种，多用于制备和手收集微生物、细胞碎片、细胞、大的细胞器、硫酸铵沉淀物以及免疫沉淀物等。
3. 超速离心机：最大转速9000 r/m ，最大离心力694000g。
4. 台式超速离心机：最大转速12000r/m ，最大离心力625000g。
（六）超净工作台：内有紫外灯、照明灯、还应有酒精灯火焰、75%乙醇等灭菌的设备，是一种提供局部洁净度的设备。其原理是鼓风机驱动空气，经过低、中效的过滤器后，通过工作台面，使实验操作区域成为无菌的环境。超净台按气流方向的不同大致有几种类型：
①侧流式：净化后气流，从左侧或右侧通过工作台面，流向对侧，或者从上往下或从下往上流向对侧，他们都能形成气流屏障而保障台面无菌。
缺点：在净化气流和外边气体交界处，可因气体的流向而出现负压，使少量的未净化气体混入，而造成污染。
②外流式：气流是面向操作人员的方向流动，从而保证外面气体不能混入。
缺点：在进行有害物质实验时，对操作人员不利，但可采用有机玻璃把上半部分遮挡起来，使气流往下方流出。（七）电泳系统：电泳技术是检测、鉴定各种生物大分子的纯度、含量及描述它们的特征，甚至还是分离、纯化、回收和浓缩样品的工具之一。核酸和蛋白质等都带有电荷，当它们被置于电场中时，能够移动。
电泳装置由两部分组成：电源装置和电泳槽装置。
① 电泳装置：电源需经稳流通过稳压器，既能提供稳定的直流电，又能输出稳定的电压。可用于三种：
常度稳压电泳仪：输出电压0-500v 0-15mA
中度稳压电泳仪：输出电压400-1000v
高度稳压电泳仪：输出电压1000以上的电源装置。
② 电泳槽装置：分两种
水平式电泳槽：一般分为微型电泳槽和大号水平式电泳槽
垂直式电泳槽：分垂直平板电泳槽和圆柱形电泳槽装置。
（八）PCR仪：Polymerase Chain Reaction仪，也称DNA热循环仪，基因扩增，它是使一对寡核苷酸引物结合到正负DNA链上的靶序列两侧，从而酶促合成拷贝数百万倍的靶序列DNA片段，它的每一循环包括在三种不同温度进行的DNA变性，引物复性，DNA聚合酶催化的延伸反应三个过程。
（九）凝胶成像分析系统:
对电泳后含溴乙锭（EB）核酸样品的观察分析。
（十）干燥设备： 3
1. 真空加热干燥箱：核酸在硝酸纤维素膜和尼龙膜上固定，用于杂交实验。
2. 电泳凝胶干燥箱：电泳后的凝胶进行脱水干燥的仪器，一般可将凝胶干燥到一些玻璃纸上，干燥后的凝胶易于保存。
3. 液氮冷冻干燥：适用于活性蛋白质样品的干燥与结晶。
4. 真空泵：许多实验都需要抽真空。如：乙醇沉淀后核酸样品的干燥，电泳凝胶的干燥等。
（十一） 其他
1. 微波炉：便于一些溶液的快速加热和定温加热，电泳琼脂糖凝胶配制、溶化等。
2. 制冰机：用于制造大多数核酸、蛋白质的实验操作所需的低温环境，以减少核酸酶或蛋白质酶的水解。
3. 层析装置：（色谱分离）是一种分离多组分混合物的有效物理方法。
真空印记系统，DNA合成/测序仪：这些都是对核酸进行深入研究的必备仪器。
4. 磁力搅拌器：多角度旋转混匀器、快速振荡混合器：用于混合仪器。
5. 组织匀浆器：超声组织及细胞破碎器，用其进行样品的分离提纯实验。
6. 通风橱：很多溶剂能逸出毒气，必备柜 ，放射性试验还要有有机玻璃屏蔽。
7. 玻璃蒸馏器、电热加帽、变压器：用于酚等有机溶剂的蒸馏。
8. Tip头、Eppendorf管：
微管移液器tip头（吸液尖）、Eppendorf管（微量离心管）可洗涤，硅化消毒后反复使用。对一些要求严格的实验，如RNA的提取、保存等操作，应使用新的消毒tip头与Eppendorf管。另外还应备有常用规格的离心管（1000ml、500 ml、250 ml、50 ml、7 ml等）及96孔、24孔、12孔、6孔的细胞培养塑料平板等。
9. 小型设备、用具：
定时器、滤膜、保鲜膜、防护眼镜鸭嘴镊、常规的玻璃或塑料器皿（包括平皿、试管、烧杯、量瓶、试剂分液漏斗、避光保存的试剂应使用棕色试剂瓶，如饱和酚、巯基乙醇等）、记号笔、各种手套PE、乳胶、家用、防酸的等）
二、本期实验所用主要仪器、 设备的功能及操作
1. 酚的重蒸馏装置：空气冷凝式玻璃蒸馏器。
一般酚是无色透明的结晶，如呈粉色或黄色，表明其中含有酚的氧化产物，如醌、二酸等，变色的酚不能用于实验，因其中的酚氧化物可破坏核酸的磷酸二酯键，并引起DNA链的交联。使用前必须在160℃-180℃重蒸馏以去除能引起RNA和DNA断裂和交联的污染杂质，从而得到纯净的酚。
2. 磁力搅拌器：81-2型恒温磁力搅拌器
将导电温度表用导线与二芯插头连接，插入后面的温度表孔内，当温度上升到预先调整好的度数时即自动停止加热（控温搅拌）。主要用于物质的快速搅拌、溶解和混匀。如配制试剂，制备酚的水饱和液等。 4
3. 蒸馏水器：1810B自动双重纯水蒸馏器，石英管加热式，本器的一次及二次蒸馏均有保护装置，使用安全可靠，热继电器当冷却水突然中断或缺水的情况下，即自动切断电源。干簧继电器控制二次蒸馏瓶内的水位，其高度应以在水位降低时能自动切断电源为准，从而达到自动控制水位的目的。
该仪器主要用于制备双蒸水和三蒸水。
4. 离心机：TGL-16G台式高速离心机，最大转速20000rpm，主要用于核酸提取时蛋白质的沉淀和有机相与水相的分层，PCR检测的瞬时离心。
5. 微量取液器：主要用于精确量取微量液体体积和核酸水相的转移。
6. 匀浆器：5ml、10ml玻璃匀浆器。
主用于组织细胞的破碎。
7. 凝胶成像分析系统
主用于核酸样品琼脂糖凝胶和PCR电泳结果的紫外观察和照像。
8. PCR仪：PTC-200基因扩增仪
体外扩增核酸的仪器
9. 蒸汽消毒锅：用于实验用试剂、器皿、用具等的灭菌清毒
有电加热式、电炉加热式两种。
10. 超净台：JJT-1300型洁净工作台，侧流式。
原理：吸进气经过初、中级过滤皿（无纺布滤过）后，再通过风机经高级过滤器（超细玻璃纤维滤纸制成）而形成洁净空气。主要是在局部空气造成洁净空气环境，以使工作区域中的悬浮粒子及微生物控制在最低限度内。
本台操作压为垂直层流压，因此出风面与操作位置不应放置多余的物品，以免妨碍气流的正常流动，影响洁净度，台面板上的孔作为通风孔，使用时避免有液体或其他物品漏入空中，以免影响内部构件。风速可调。
使用：75%乙醇消毒2-3次，摆放好实验用品。插上电源，紫外消毒30分钟，启动风机5m后关灯，关灯后10分钟打开照明灯，即可使用。
11. 电泳系统：
①电泳仪：HV-3000型高度三恒多用电泳仪（恒压、恒流、恒功率）
②电泳槽：水平式两种。
12．微波炉：主要用于琼脂糖的快速溶解。