如何提升crispr效率

2025-03-30 22:21:02

推荐回答（4个）

回答1：

01

大多数植物基因组编辑研究利用来自化脓性链球菌（Streptococcus pyogenes）的CRISPR-Cas9系统（SpCas9）。spCas9的识别依赖于特定的PAM序列NGG，这大大限制了该系统的编辑位点选择范围。为了解决这个问题，研究人员们从不同方向入手，寻找解决的办法。
2016年3月，中国水稻研究所王克剑课题组的研究人员通过对Cas9蛋白进行定点突变，获得了Cas9蛋白的VQR变体，并在水稻基因组中成功实现对NGA邻近序列的编辑，极大的扩展了基因编辑位点的选择范围（Hu et al.,2016）。然而CRISPR-Cas9-VQR系统与原CRISPR-Cas9系统相比较，其编辑效率依然偏低，这限制了该系统在水稻中的推广应用。

2017年6月12日，王克剑团队与中科院遗传与发育生物学研究李家洋团队合作，在Plant Biotechnology Journal发表了题为“Increasing the efficiency of CRISPR-Cas9-VQR precise genome editing in rice”的文章( Hu et al.,2018)，通过优化sgRNA的结构以及使用水稻内源性强启动子来驱动Cas9及VQR变体的表达，显著提高了CRISPR-Cas9及CRISPR-Cas9-VQR系统在水稻中的基因组编辑效率。通过试验，水稻中的编辑效率最高可达到近80%，提升幅度最高可达8倍。于此同时，该系统可以通过同位酶连接方式串联多个sgRNA同时进行多位点编辑（构建方法可参考王克剑团队王春博士2015年发表在Journal of Genetics and Genomics上的文章; Wang et al.,2015）。在多位点编辑时，效率提升幅度更加明显，可以达到15倍。因此，修饰后的CRISPR-Cas9-VQR系统将成为多NGA靶标位点编辑的强大工具。

回答2：

11月28日《PNAS》杂志报道了约翰霍普金斯大学科学家开发的新DNA序列编辑法则。

“作为一个已被广泛使用的基因修改工具，CRISPR本身只会造就基因组断裂，它并不能控制一段新DNA序列如何插入基因组，”约翰霍普金斯大学医学院负责本院基础科研相关工作的副院长Geraldine Seydoux博士说。“于是，我们想了解细胞修复DNA断裂损伤的天然机理，利用这种机制，在CRISPR处理后更高效地为基因组引入新序列。”

“我们惊讶地发现，只要外源DNA是线性的，细胞就非常乐意复制这条外源序列来修复自己的DNA断裂，”Seydoux补充道。“通过反复研究外源DNA片段的复制过程，我们提出了一些简单而有效的法则，显著改善了CRISPR的编辑效果。”

（通过CRISPR切割引入编码荧光蛋白的PCR片段，同源臂长度只需33个核苷酸）

本质上，CRISPR是一把分子剪刀。科学家们普遍认为，CRISPR剪切后，细胞通过插入一组随机核苷酸来修复DNA断裂，通常来讲，DNA发生断裂的基因就这样被破坏了。

细胞有时也会使用来自供体的DNA修复断裂，但这些新供体序列自己不能主动插入基因组的切口。它们需要在“同源臂（homology arms）”的帮助下让两个末端与基因组上切口两端的序列连接。同源臂的DNA序列需要与其插入的DNA切口两端的遗传密码完全匹配。

尽管如此，科学家们认为这种依靠供体DNA序列的基因组修复方法十分低效。如果插入片段很长，它可能需要较长的同源臂，制备起来就很困难。

划重点

为了解决这些问题，约翰霍普金斯的科学家们尝试向人类胚胎肾细胞中注入各种各样的供体DNA组合。它们发现，线性DNA片段供体的工作效率最高，是环状DNA（质粒）的2到5倍。“线性DNA我们用PCR就能生产，”助理研究员Alexandre Paix说。

他们还测试了不同长度的同源臂，发现约35个核苷酸的效果最好，这实际上比科学界普遍采用的同源序列长度要短得多。

具体来说，实验证明由33到38个核苷酸组成的同源臂与由518个核苷酸组成的同源臂成功率相当：最优编辑条件下的成功率约10-20%。

相反，采用15-16个核苷酸长度的同源臂时，成功率下降了一半。研究人员在基因组的三个不同位置检测，都得到一致的结果。

他们还发现，插入序列的长度（不包括同源臂）最高可容纳1000个核苷酸。1000以下的成功率大约为10-50%，超过1000（例如1122和2229个核苷酸）成功率下降至0.5%。“细胞一次性可能处理不过来这么多的DNA，”Seydoux说。

文章建议，在CRISPR剪切位点附近30个核苷酸以内插入，这样编辑的成功率最高。他们表示，这些参数应该适用于目前正在被研究的绝大多数基因。

最后，他们还在小鼠胚胎中测试了这些“法则”的效果。利用带有36个核苷酸同源臂的PCR片段，该小组成功地将一个长度为739的荧光蛋白编码基因插入了87只小鼠胚胎中的27只，成功率达到了31%。

原文检索：

Precision genome editing using synthesis-dependent repair of Cas9-induced DNA breaks

来源：生物通

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回答3：

CRISPR基因编辑技术的研究和讨论却异常火热。甚至讨论CRISPR都不再是生物界的专利，科幻电影、热点新闻让它成为了知名公众号、论坛、微博、大街小巷的普通民众都津津乐道的话题。似乎从被发现以来，CRISPR就掀起了一阵又一阵基因编辑的热潮。全球各地的科研团队前赴后继地用研究成果来推进这项技术的发展和进步，热情经久不衰。

随着技术的不断进步和推广，CRISPR质粒的构造越来越多样化，适用的物种越来越多，信息和资源的交流也异常活跃。近日，MolecularCloud质粒共享平台迎来了一批非常有价值的质粒资源。无独有偶，这些质粒都是侧重于提升CRISPR基因编辑系统在作物中的编辑效率。是巧合，却也从一方面体现了该研究领域的火热程度。今天就让我们一起用知识取暖，感受一下CRISPR技术的阵阵暖风。

01

大多数植物基因组编辑研究利用来自化脓性链球菌（Streptococcus pyogenes）的CRISPR-Cas9系统（SpCas9）。spCas9的识别依赖于特定的PAM序列NGG，这大大限制了该系统的编辑位点选择范围。为了解决这个问题，研究人员们从不同方向入手，寻找解决的办法。

2016年3月，中国水稻研究所王克剑课题组的研究人员通过对Cas9蛋白进行定点突变，获得了Cas9蛋白的VQR变体，并在水稻基因组中成功实现对NGA邻近序列的编辑，极大的扩展了基因编辑位点的选择范围（Hu et al.,2016）。然而CRISPR-Cas9-VQR系统与原CRISPR-Cas9系统相比较，其编辑效率依然偏低，这限制了该系统在水稻中的推广应用。

2017年6月12日，王克剑团队与中科院遗传与发育生物学研究李家洋团队合作，在Plant Biotechnology Journal发表了题为“Increasing the efficiency of CRISPR-Cas9-VQR precise genome editing in rice”的文章( Hu et al.,2018)，通过优化sgRNA的结构以及使用水稻内源性强启动子来驱动Cas9及VQR变体的表达，显著提高了CRISPR-Cas9及CRISPR-Cas9-VQR系统在水稻中的基因组编辑效率。通过试验，水稻中的编辑效率最高可达到近80%，提升幅度最高可达8倍。于此同时，该系统可以通过同位酶连接方式串联多个sgRNA同时进行多位点编辑（构建方法可参考王克剑团队王春博士2015年发表在Journal of Genetics and Genomics上的文章; Wang et al.,2015）。在多位点编辑时，效率提升幅度更加明显，可以达到15倍。因此，修饰后的CRISPR-Cas9-VQR系统将成为多NGA靶标位点编辑的强大工具。

回答4：

作为一个已被广泛使用的基因修改工具，CRISPR本身只会造就基因组断裂，它并不能控制一段新DNA序列如何插入基因组，”约翰霍普金斯大学医学院负责本院基础科研相关工作的副院长Geraldine Seydoux博士说。“于是，我们想了解细胞修复DNA断裂损伤的天然机理，利用这种机制，在CRISPR处理后更高效地为基因组引入新序列。”

“我们惊讶地发现，只要外源DNA是线性的，细胞就非常乐意复制这条外源序列来修复自己的DNA断裂，”Seydoux补充道。“通过反复研究外源DNA片段的复制过程，我们提出了一些简单而有效的法则，显著改善了CRISPR的编辑效果。”

（通过CRISPR切割引入编码荧光蛋白的PCR片段，同源臂长度只需33个核苷酸）

本质上，CRISPR是一把分子剪刀。科学家们普遍认为，CRISPR剪切后，细胞通过插入一组随机核苷酸来修复DNA断裂，通常来讲，DNA发生断裂的基因就这样被破坏了。

细胞有时也会使用来自供体的DNA修复断裂，但这些新供体序列自己不能主动插入基因组的切口。它们需要在“同源臂（homology arms）”的帮助下让两个末端与基因组上切口两端的序列连接。同源臂的DNA序列需要与其插入的DNA切口两端的遗传密码完全匹配。

尽管如此，科学家们认为这种依靠供体DNA序列的基因组修复方法十分低效。如果插入片段很长，它可能需要较长的同源臂，制备起来就很困难。

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