A、F2表现型的比例为3：1是性状分离比，不是说明基因分离定律实质，A错误；
B、F1产生配子的比例为1：1，说明减数分裂时等位基因随同源染色体的分开而分离，产生不同配子的比例为1：1，因而最能说明基因分离定律实质，B正确；
C、F2基因型的比例为1：2：1只能体现子二代的基因型种类及比例，不能说明基因分离定律实质，C错误；
D、测交后代表现型的比例为1：1是性状分离比，说明F1产生配子的比例为1：1，D错误．
故选：B．
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