（1）器具的消毒。组培前玻璃器皿等要用洗衣粉刷洗干净备用。接种室和超净工作台用70%酒精擦洗，并用紫外光照射。其他用具也要进行高温消毒。
（2）培养材料的采集。组培所用的植物材料可采用根、茎、叶、花、芽及种子的子叶、胚轴的一部分，有时也可利用花粉或花药。通常应取初生幼嫩的材料，这些材料在移入培养基时都必须保持鲜嫩状态，否则组培将会失败。
（3）培养材料的消毒。先将采集来的材料用自来水冲洗干净，再用蒸馏水冲洗2～3遍，然后用无菌纱布将材料上的水分吸干，切成小块，放入70%酒精中浸泡15～30秒，再用30%漂白粉澄清液浸泡20分钟消毒，最后用无菌水冲洗3～5遍。
（4）制备外植体。将上述经过灭菌的材料，用在火焰上消过毒的刀、剪、镊，在消毒滤纸上剥去芽的鳞片，嫩枝的外皮和种皮胚乳等，然后切成长0.2～0.5厘米的小片（这些小片就是外植体）。在操作过程中，严禁用手触动这些材料。
（5）接种培养。在无菌条件下将切好的外植体立即接种在培养基上。接种后所用试管和三角瓶都要用无菌药棉封口，放培养室培养架上培养。每天用日光灯照12～16小时。保持在25℃±20℃。也可采用变温培养，夜间温度略低于白天。
植物细胞组织培养
一．实验目的
植物细胞和组织培养的技术性强,要求无菌操作,通过本实验可初步掌握常规的组织培养技术,加深对无菌操作的了解.
二．实验原理
植物的全能性：植物体的任何一个细胞都具有生长分化成为一个完整植株的能力,称为植物的全能性.
植物组织培养就是利用植物的全能性进行离体无菌植物培养的一门技术.植物组织培养按其原始意义,就是指愈伤组织培养.但发展至今,其范围日益扩大,已包括植物和它的离体器官、组织、细胞和原生质体的离体无菌培养.因此,拥有几种不同水平的培养技术,即整体的、器官的、组织的、细胞的和原生质的培养技术.它们的涵义是：
1．植株培养.指以具备完整植株形态的材料（如幼苗和较大的植株）外植体的无菌培养.
2． 胚胎培养.指以从胚珠中分离出来的成熟或未成熟胚为外植体的离体无菌培养.
3． 器官培养.指以植物的根,茎,叶,花,果等器官为外植体的离体无菌培养,如根的根尖和切段,茎的茎尖,茎节和切段,叶的叶原基,叶片,叶柄,叶鞘和子叶,花器的花瓣,雄蕊（花药,花丝）,胚珠,子房,果实等的离体无菌培养.
4． 组织培养.指以分离出植物各部位的组织（如分生组织,形成层,木质部,韧皮部,表皮,皮层,胚乳组织,薄壁组织,髓部等）,或已诱导的愈伤组织为外植体的离体无菌培养.这是狭义的组织培养.
5． 细胞培养.指以单个的游离细胞（如用果酸酶从组织中分离的体细胞,或花粉细胞,卵细胞）为接种体的离体无菌培养.
6． 原生质体培养.指以除去细胞壁的原生质体为外植体的离体无菌培养.
本实验选择烟草和豌豆为材料,烟草（Nicotiana）属茄科植物,是重要的工业原料,也是植物组织培养的四大典型实验植物（烟草、矮牵牛、胡萝卜、芸苔）中重要的一种,它的研究的最为广泛,也始终领先于其他的植物材料,目前,66个烟草品种中,再生成植株的有16个种,通过花药培养再生成花粉植株的有12个种,通过原生质体培养再生成植株的有20个种,通过烟草的种内和种间原生质体融合再生成杂种的植物分别为3个和12个种.豌豆（Pisum sativum）属豆科植物,是粮食、饲料和重要的蔬菜作物,也是遗传学家和植物生理学家感兴趣和乐于采用的实验植物,豌豆的根、茎、子叶、下胚轴、上胚轴、花芽等外植体,皆可形成愈伤组织,其中茎尖、幼胚、幼叶等器官可成功的再生成植株.茎尖培养可包括小至十几微米的茎尖分生组织（生长点）和大至几十毫米的茎尖或更大的芽培养.在实践应用上,常采用生长点的培养使患病植物去病毒,以达到挽救优良品种,提高产量和质量之目的.
三．实验材料
仪器设备
1．酒精灯、100ml三角烧瓶,9厘米培养皿；
2．镊子、剪刀、解剖针；
3．双筒解剖显微镜；
4．光照培养箱或温室；
材料和试剂
1．材料 烟草无菌苗、豌豆幼苗.
2．试剂
（1）MS培养基,植物激素：NAA、6-BA等；
（2）饱和漂白粉液（次氯酸钠）；
（3）70%酒精、100%酒精、酒精棉球；
（4）无菌水
四．实验步骤
1．烟草无菌苗的快速切繁—继代培养：（要求完全无菌操作）
每组一瓶烟草无菌苗,请细心操作,以免污染.
（1） 在实验台上,点着酒精灯,将双手用酒精棉球擦拭消毒,打开生长好无菌烟草苗的三角瓶,三角瓶的瓶口使用前后需在酒精灯外焰上烧过灭菌.
（2） 用灭菌的镊子轻轻捏出1株幼苗,用灭菌的剪刀将无菌苗剪成0.5-1厘米的小段,要求每段至少包含一个生长点,直接剪入盛有MS培养基的三角瓶中,每一个切段必须直接接触培养基,三角瓶口重新烧过灭菌,并重新封好口.
（3） 在光照培养箱中15~25℃,16小时光照条件下培养4周,可长成完整植株,能用于田间移栽.
2．豌豆苗的茎尖培养
⑴ 取发芽6天的豌豆幼苗10株,简取1厘米左右的茎尖,浸入70%的酒精中1分钟,再浸入饱和次氯酸钠溶液中消毒15分钟,（此步以后要求无菌）用无菌水中冲洗5次,在灭菌的滤纸上吸干水分,放入灭菌的培养皿中.
⑵ 在双目解剖镜下,用灭菌的解剖针剥去幼叶露出生长锥,用灭菌的解剖针挑取带着两至三个叶原基的生长锥.
⑶ 将挑好的茎尖移到MS+10.7μmol/L萘乙酸(NAA)+4.4μmol/L 6-苄基腺嘌呤（6-BA）的培养基上诱导愈伤组织形成,用封口膜将培养皿封好.
[4]在恒温培养箱中,26℃下,培养六周,形成愈伤组织,经继代后,可用于生根培养.
第46批a7 2014-12-06
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